實(shí)時(shí)
熒光-PCR法是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的技術(shù)。它通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。
對(duì)熒光-PCR法的數(shù)據(jù)處理我們要了解一個(gè)關(guān)鍵的因素“Ct值”。在實(shí)時(shí)定量PCR的數(shù)據(jù)圖中,x-軸表示PCR循環(huán)數(shù),y-軸表示擴(kuò)增反應(yīng)的熒光值,也就是擴(kuò)增產(chǎn)物的量。這個(gè)圖中有基線、閾值、Ct值這幾個(gè)概念,從這幾個(gè)值我們能夠最終得到模板中目的基因的含量。
基線是擴(kuò)增曲線中的水平部分。在反應(yīng)初階段,雖然產(chǎn)物是指數(shù)級(jí)增長(zhǎng),但是由于總量太少,其熒光處于背景水平,檢測(cè)不到熒光增加。因此基線信號(hào)的產(chǎn)生是由于測(cè)量的偶然誤差引起的。然而當(dāng)累積了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物,足以產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)時(shí),這個(gè)信號(hào)的值就被稱為閾值,通常閾值默認(rèn)為基線信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差×10。在閾值的前后,PCR的反應(yīng)仍然是指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)的,因此此時(shí)的PCR結(jié)果可靠,可以準(zhǔn)確地反映體系中模板的初始量。Ct值是信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù),也就是擴(kuò)增曲線與閾值的交叉點(diǎn)。
為什么知道了Ct值就能夠得到初的目的基因含量呢?
一個(gè)基因的單次反應(yīng)擴(kuò)增曲線中要計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的分子數(shù)N,它等于模板的分子數(shù)乘以1+擴(kuò)增效率的n次方,n代表循環(huán)次數(shù)。也就是說(shuō),如果擴(kuò)增效率為100%,產(chǎn)物分子數(shù)就等于模板數(shù)乘以2的n次方。但是顯然,在線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期,擴(kuò)增效率不可能是100%,因此上述PCR理論方程只在指數(shù)期成立。