熒光-PCR法是利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進入平臺期。將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進行PCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在線性關(guān)系，可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。
熒光-PCR法實驗成功的因素離不開優(yōu)良試劑的選擇：
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量直接影響定量的準(zhǔn)確性。建議使用標(biāo)準(zhǔn)品專用稀釋Buffer稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
2.根據(jù)采用的熒光檢測方法進行試劑選擇。選擇探針法專用試劑。
3.RT-PCR要根據(jù)實驗?zāi)康倪M行試劑選擇。mRNA表達量分析選擇兩步RT-PCR試劑，病毒病原菌檢測選擇一步RT-PCR試劑。
4.PCR反應(yīng)通常樣品數(shù)量較多，操作步驟過多易產(chǎn)生錯誤。選擇PCR反應(yīng)用Buffer、DNA聚合酶、dNTP等試劑已經(jīng)預(yù)混在一起的試劑，操作更加簡單方便。同時，使用的試劑最好不需要進行Mg2＋濃度的優(yōu)化等實驗。
5.PCR反應(yīng)對反應(yīng)特異性要求高。最好選擇應(yīng)用DNA聚合酶的試劑。但有一點需要強調(diào)，DNA聚合酶有兩種類型，即化學(xué)修飾型和抗體結(jié)合型。使用這兩種DNA聚合酶的PCR反應(yīng)條件不同，使用化學(xué)修飾型DNA聚合酶，需要在PCR條件的起初步驟設(shè)置10-15分鐘的熱變性程序，以恢復(fù)DNA聚合酶的活性；而抗體結(jié)合型DNA聚合酶，不需長時間的熱變性步驟，通常的PCR條件即可恢復(fù)DNA聚合酶的活性，適合快速PCR反應(yīng)。
6.所選試劑要與使用的RT-PCR檢測系統(tǒng)相匹配。最好選擇對各種機型裝置都顯示良好反應(yīng)性能的試劑。
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更新時間：2021-05-12
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